来源:中华实用医药杂志 作者:李均何立群李屹 2005-9-22
【摘要】 目的 探讨高蛋白饮食及量蛋白尿对慢性肾衰大鼠的加重损害作用 方法 通过先用5/6肾切除大鼠制作慢性肾功能衰竭的动物模型,成功后再分别给予5/6肾切除大鼠不同蛋白饮食喂养2月,制作有大量蛋白尿的慢性肾衰动物模型。生化检测不同蛋白饮食喂养的5/6肾切除大鼠血BUN、SCr、24h尿蛋白定量;放免检测血内皮素(ET)、血栓素B 2 (TXB 2 )、6-酮-列腺素F1α(6-keto-PGF1α);分光光度计比色法检测血和肾组织SOD、MDA、GSH-PX水平。 结果 给予5/6肾切除大鼠高蛋白饮食,可诱导建立CRF大鼠大量蛋白尿模型;高蛋白饮食及大量蛋白尿可通过加重CRF大鼠的血液动力学异常(升高血栓素B 2 、内皮素,降低血6-酮-前列腺素F1α);减弱大鼠血超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,加速肾损害。 结论 高蛋白饮食可通过导致5/6肾切除大鼠大量蛋白尿,影响肾脏血管活性物质表达,降低5/6肾切除大鼠抗氧化能力而加速慢性肾衰的进展。
蛋白尿既是各慢性肾脏病的主要临床症状,又是慢性肾脏病进展的独立危险因素之。研究表明:没有蛋白尿的肾小球肾炎,肾功能极少发生进行性衰退,大量蛋白尿对肾脏具有直接损伤作用,可以使原有的肾小球损害逐渐加重,促使肾小球硬化的发生 [1] 。因此,积极研究高蛋白饮食及大量蛋白尿加重慢性肾衰进展的作用,有重要的临床指导意义。现将我们通过给予5/6肾切除大鼠高蛋白饮食,观察高蛋白饮食及大量蛋白尿对慢性肾衰大鼠的加重损害作用的研究报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 成年雄性SD大鼠40只,6~8周龄,体重160~190g(上海必凯实验动物有限公司提供),大鼠在上海中医药大学实验动物中心(具有上海市实验动物管理委员会颁发的合格证书)分笼饲养于12h光照,45%左右相对湿度的普通设施中自由饮食。大鼠适应1周后,随机抽取7只作正常组,其余33只为造模组,正常组给予自由进食及饮水。慢性肾衰模型制作依照参照文献 [2,3] 进行,造模组:先以苯巴比妥(100mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,然后以乙醚诱导麻醉,使大鼠仰卧,下肢交叉固定于手术台上以暴露背部左肾区,从距左脊肋骨1.5cm处做斜向外切口。经后腹膜取肾脏,暴露皮质部分,用明胶海绵压迫止血片刻,再滴加滴纤维蛋白原溶液或凝血酶溶液,稍等片刻,当切面上不再有活动性出血后复位剩余左肾,缝合,1周后切除整个右肾,2次手术共切除肾脏约80%左右。2周后在大鼠尾静脉采血测定血肌酐(SCr),造模组大鼠血肌酐显著高于正常组为造模成功,共有27只造模成功。再根据造模组大鼠的血肌酐值将其分为3组(每组9只),保证各组间血肌酐差异无显著性(P>0.05)。(1)普通组:给予普通饲料喂养;(2)中蛋白组:给予普通饲料+20%的蛋白喂养;(3)高蛋白组:给予普通饲料+40%的蛋白喂养,各组均自由进食及饮水,共喂养2个月。实验结束,普通组死亡1只,中蛋白组和高蛋白组均死亡2只。
1.2 观察指标及方法 (1)提前1周开始收集各组大鼠的蛋白尿检测24h尿蛋白定量,常规检测血BUN、SCr。(2)血内皮素(ET)、血栓素B 2 (TXB 2 )、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)采用放射免疫法,曙光医院同位素室检测。(3)血和肾组织超氧化物岐化酶(SOD)、MDA、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量,采用分光光度计比色法。肾组织匀浆制备:取下大鼠残肾组织即刻制成10%的组织匀浆,标本测定过程均严格按说明书要求进行。(4)用光镜(HE)观察肾脏组织病理,送病理室观察。
1.3 统计学方法 所有数据用SPSS11.5软件处理,组间比较采用单因数方差分析(One-Way ANOVA)。
2 结果
2.1 不同蛋白饲料喂养2个月后,CRF大鼠肾功能及蛋白尿结果比较 见表1。
表1 不同蛋白饲料喂养2个月后CRF大鼠肾功能及蛋白尿结果比较 (略)
注:与高蛋白模型组比较, ★ P<0.05, ★★ P<0.01;与正常组比较, △ P<0.01
结果显示:各模型组尿素氮均显著高于正常组(P<0.05),3个模型组之间随着蛋白饮食的增加,BUN虽然有上升趋势,但统计学比较差异无显著性;各模型组SCr、蛋白尿值均显著高于正常组(P<0.01),普通模型组和中蛋白模型组的SCr及24h尿蛋白定量均显著低于高蛋白模型组(P<0.05,P<0.01),普通模型组及中蛋白模型组24h尿蛋白定量约为正常大鼠的10倍,而高蛋白模型组24h尿蛋白定量约为正常大鼠的20倍,说明给予5/6肾切除大鼠高蛋白饮食,会使其24h尿蛋白定量及血肌酐显著升高,从而建立有大量蛋白尿CRF动物模型。
2.2 不同蛋白饮食对CRF大鼠血管活性物质结果比较 见表2。
表2 不同蛋白饮食对CRF大鼠血管活性物质结果比较(略)
注:与高蛋白模型组比较, ★ P<0.05;与正常组比较, △ P<0.01, △△ P<0.05
结果表明:普通模型组、中蛋白模型组及高蛋白模型组的血ET、TXB 2 均明显高于正常组(P<0.01),6-keto-PGF1α明显低于正常组(P<0.01);3个模型组间血ET有上升趋势,而6-keto-PGF1α有下降趋势,但无统计学意义(P>0.05);而高蛋白模型组的血TXB 2 则明显高于普通模型组及中蛋白模型组(P<0.05),提示CRF大量蛋白尿组存在血管活性物质异常,且以TXB 2 异常为明显,大量蛋白尿可通过升高CRF大鼠的血TXB 2 而加重肾衰。
2.3 不同蛋白饮食对CRF大鼠血氧化指标结果比较 见表3。
表3 不同蛋白饮食对CRF大鼠血氧化指标结果比较 (略)
注:与高蛋白模型组比较, ★ P<0.01;与正常组比较, △△ P<0.05, △ P<0.01
结果表明:各模型组血SOD、GSH-PX值明显低于正常组(P<0.01,P<0.05)。随着蛋白饮食的增加,SOD、GSH-PX值下降,以高蛋白模型组最明显,高蛋白模型组SOD、GSH-PX值明显低于普通模型组(P<0.05)。各模型组血MDA明显高于正常组(P<0.01),随着蛋白饮食的增加,血MDA逐渐增加,以高蛋白模型组为甚,说明不同蛋白饮食喂养的CRF大鼠血氧化与抗氧化指标存在异常,以高蛋白饮食组最严重,推测高蛋白饮食可明显降低CRF大鼠的SOD、GSH-PX,增加血MDA,加重慢性肾衰。
2.4 不同蛋白饮食对CRF大鼠肾组织氧化指标结果比较 见表4。
表4 不同蛋白饮食对CRF大鼠肾组织氧化指标结果比较(略)
注:与普通模型组比较, * P<0.05;与正常组比较, △ P<0.01, △△ P<0.05
结果表明:正常组大鼠肾组织的SOD、GSH-PX均明显高于各模型组(P<0.01,P<0.05),随着蛋白饮食的增加肾组织MDA有上升趋势,但无统计学意义。中蛋白模型组肾组织SOD明显低于普通模型组(P<0.05)。GSH-PX随蛋白饮食的增加无明显变化。
3 讨论
3.1 高蛋白饮食及大量蛋白尿对慢性肾衰的直接损害作用 本研究给予经典的5/6肾切除CRF动物模型大鼠高蛋白饮食(普通饮食加40%蛋白)2个月,成功诱导出有大量蛋白尿的CRF模型,其模型组大鼠SCr为(315±77.32)mmol/L,24h蛋白定量为(248.08±66.19)mg/d达到正常大鼠的20倍,普通模型组和20%蛋白模型虽已达正常大鼠的10倍左右,但仅为经典的大量蛋白尿模型值的1/2左右。研究表明:蛋白尿对肾小球的直接损害,是由于通过肾小球毛细血管的蛋白导致肾小球系膜扩张,而引起肾小球滤过面积和滤过率下降。大量蛋白尿对肾小球上皮细胞及系膜细胞的内在毒性作用表现在肾小球超滤液中大量蛋白尿可引起上皮细胞的形态改变,如足突消失,继而出现持续性结构和功能改变,包括肾小球的变性、坏死、上皮细胞从基底膜分离,肾小球硬化 [4] 。且蛋白尿的大量漏出,使近端小管细胞蛋白负荷过重,小管细胞膨胀、破裂而释放出溶酶体酶导致小管间质损害及纤维化,导致CRF [5] 。进一步研究显示:过量的蛋白在肾小管上皮细胞的沉积可刺激某些生长因子如血小板源生长因子(PDGF)以及转化生长因子β等的产生,些细胞因子可引起肾小管上皮细胞的活化、大量胶原的产生和间质细胞的增殖,最终导致间质纤维化和CRF的出现 [6] 。可见,高蛋白饮食及大量蛋白尿可直接损害肾小球和肾小管而加重肾损害。
3.2 高蛋白饮食及大量蛋白尿对CRF大鼠肾脏血管活性物质的影响 已知ET是一种含21个氨基酸,分子量为2492D的能收缩血管的小分子活性肽。其在CRF大鼠及患者血、尿及肾组织局部ET-1含量增高,可加重肾脏损害:(1)ET对血管有强大的收缩作用,而肾血管对ET的反应尤为敏感。ET对肾小球出球动脉的收缩作用强于入球动脉,从而使肾小球毛细血管内压升高,还可收缩肾小球系膜细胞使肾小球滤过面积和超滤系数减少。并可剂量依赖性地减少肾血流量,降低肾小球滤过率 [7] ;(2)ET-1促进血管平滑肌及肾髓质间质细胞增殖及间质纤维化,直接或间接刺激醛固酮分泌,影响肾素活性及促炎症作用 [8] 。
TXA 2 、PGI 2 均系花生四烯酸的代谢产物,血管内皮细胞合成PGI 2 ,血小板、肾小球上皮细胞、系膜细胞、中性粒细胞及单核细胞等均可合成TXA 2 ,PGI 2 具有扩张血管及抗血小板聚集作用,而血小板生成的TXA 2 则可诱导血小板聚集及血管收缩,两者的作用相反。正常时保持动态平衡,对维持血小板功能、保护血管和防止血栓形成具有重要意义,因而PGI 2 与TXA 2 是调节血小板及血管壁功能状态的两个生物学对立面。PGI 2 可拮抗内皮素所引起的肾血管收缩,有负反馈调节作用。血管损伤可引起TXA 2 等致炎因子释放,这些炎症介质大能刺激内皮素的合成和分泌,而内皮素又可促进TXA 2 、IL-6等炎症介质的生成 [9,10] 。TXB 2 和6-keto-PGF1α为TXA 2 和PGI 2 的终末代谢产物,可反映TXA 2 和PGI 2 两者水平。若TXA 2 增多和(或)PGI 2 减少,TXA 2 /PGI 2 比值升高,可导致血小板活化增强和血管收缩,促进血栓形成和血管损伤 [11,12] 。
本研究表明:各模型组大鼠的血ET、普通模型组和40%模型组TXB 2 显著高于正常组,而3模型组的6-keto-PGF1α显著低于正常组,且随着蛋白饮食的增加模型大鼠血ET有上升趋势,而6-keto-PGF1α则呈下降趋势,TXB 2 在高蛋白导致的大量蛋白尿模型组上升更明显,明显高于普通模型组及中蛋白模型组,表明CRF各模型组大鼠均存在血管活性物质的异常,而高蛋白饮食使肾脏血管活性物质异常表达更明显。可见高蛋白饮食可通过加重CRF大鼠血管活性物质异常表达,而加速肾脏的病理进程。
3.3 高蛋白饮食及大量蛋白尿对CRF大鼠血和组织氧化指标的影响 在正常情况下肾组织内大约1%~2%的氧发生单电子转移形成自由基,因肾组织内含有丰富的SOD、过氧化氢酶、GSH-PX及其他抗氧化物质,产生的自由基很快被清除。因此肾组织内抗氧化能力与不断产生自由基的氧化能力之间保持着动态平衡,不引起肾组织损伤 [13] 。本研究表明:各模型组血SOD、GSH-PX值明显低于正常组(P<0.01,P<0.05),随着蛋白饮食的增加,SOD、GSH-PX值下降,以高蛋白饮食组最明显,高蛋白饮食组SOD、GSH-PX值明显低于普通模型组(P<0.05)。各模型组血MDA明显高于正常组(P<0.01),随着蛋白饮食的增加,血MDA逐渐增加,以高蛋白模型组为重,说明不同蛋白饮食喂养的CRF大鼠血存在氧化与抗氧化能力动态平衡异常,以高蛋白饮食组最为严重。但组织的变化不明显,正常组大鼠肾组织的SOD、GSH-PX均明显高于各模型组(P<0.01,P<0.05),随着蛋白的增加肾组织MDA有上升趋势,但无统计学意义。说明不同蛋白饮食喂养的CRF大鼠存在氧化和抗氧化系统的异常,导致氧自由基的产生,已知后者可进一步通过以下途径损伤肾脏:(1)氧自由基可直接损伤肾小球内皮、上皮及系膜细胞,造成内皮细胞脱落,上皮细胞空泡变性,足突融合,GBM暴露,系膜基质溶解,系膜基质代偿增多;(2)由于上述病变,改变肾小球毛细胞血管和GBM的通透性及肾小球内血流动力学,造成大量持续性蛋白尿,反之这些蛋白尿加重系膜细胞及肾小球的损伤;(3)TGF-β,PDGF等多种细胞因子在CRF时产生增多,通 过ROS进一步损伤肾组织 [14,15] 。(4)脂质过氧化物使纤维母细胞对胶原基因的表达增加,促进胶原在系膜区沉积,加重肾间质纤维化,使肾组织结构和形态改变,肾功能进行性损害 [16] 。
可见,高蛋白饮食及大量蛋白尿既可直接损害肾脏,又可间接通过影响肾脏的血管活性物质分泌、减弱机体的抗氧化能力而加速肾脏疾病的恶化。
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(编辑文 静)
* 基金项目:上海市科委资助课题(编号:01DJ19013)
作者单位:519100广东珠海遵义医学院第五附院中医科
200021上海中医药大学附属曙光医院肾内科